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不同植被根际土壤中可培养与未培养粘细菌的多样性研究
发布日期:2018-01-31  来源:生物多样性   浏览次数:37
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粘细菌是一类革兰氏阴性细菌、具有复杂形态发生行为﹝1﹞、可形成多细胞子实体结构和抗逆的粘孢子,在系统进化上,粘细菌位于变形菌门(Proteobacteria)的δ变形菌亚纲(Deltaproteobacteria)﹝2﹞,共分属3个亚目、8个科,23个属、50多个种﹝3-7﹞。粘细菌产生的次级代谢产物,具有结构新,种类多,作用机制新颖多样的特性,目前被公认为是仅次于放线菌之后的第二类药源微生物的新类群﹝8-9﹞。
目前,对粘细菌的多样性研究,一直以来都是采用平板培养分离方法对其可培养粘细菌的多样性研究﹝10-15﹞,但这种传统分离方法不仅耗时耗力,而且不能很好的反映土壤粘细菌多样性的初始状态,因为土壤中许多存活但不可培养的粘细菌不能被分离、鉴定。利用分子生物学方法可克服传统分离方法的缺陷﹝16﹞。到目前为止,尚未报道不同植被根际土壤可培养与未培养粘细菌多样性研究的相关报道。本研究采用传统的辅助菌诱导方法,对样品的粘细菌进行分离纯化,通过形态结合16S rRNA基因的序列分析,确定粘细菌的系统分类地位;利用基于粘细菌特异性引物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)﹝17﹞分析粘细菌的多样性。
1 材料和方法
1. 1 材料
1.1.1 样品采集
采自越南铁木、亚热带常绿阔叶林、针叶林、红树林和樟木的根际土壤,采集后,为防止霉菌的污染,立即自然室温风干,放入4oC冷库保存备用。
1.1.2 主要培养基﹝7﹞
水琼脂培养基 (WCX) 、VY/2 培养基、LB培养基
1.2 样品的处理
取风干的土样2.5~3 g ,用含100 μg/ml 放线菌酮的无菌水浸泡过夜,6000 rpm 离心5min收集样品。
1.3 粘细菌子实体的诱导
用E.coil、Achromobacter sp.两种被捕食菌菌浆在WCX培养基上划十字交叉线,30min后在十字线交叉点处接种黄豆大的经放线菌酮处理的土样,30℃恒温培养,4天后观察子实体的形成。
1.4 纯化与保藏
挑取可疑菌株接种于LB 液体培养基进行验纯,纯化的菌株分别用VY/2斜面、15%甘油及冻干管保藏。
1.5 土壤DNA的提取及扩增
土壤DNA的提取使用Magen公司购买的土壤DNA提取试剂盒,按照操作说明进行提取。
PCR扩增:mglA基因的半巢式PCR扩增[18] ,使用引物分别为mglA1F(5′-CGCGAAATCAACTGCAAGAT-3′)与mglA5R(5′-GGCAGGTCGCGCTTGTTGTACTG-3′);及引物mglA4F(5′-CAGGTGTTCTACGACGCCA-3′)与 mglA5R(5′-GGCAGGTCGCGCTTGTTGTACTG-3′)[19]。PCR扩增体系均为25μL:10×PCR 缓冲液5.0μL,10 μmol/L dNTPs 1.0 μL,mglA1F(或mglA4F)10 μmol/L 1μL,mglA5R 10 μmol/L 1μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL,ddH2O 20μL。第一轮PCR反应条件为:95℃预变性5 min,95℃变性45 s, 56℃退火45 s,72℃延伸30 s, 共进行35 个循环,最后72℃延伸10 min。第二轮PCR采用touch-down PCR,反应条件为:95℃预变性5 min,95℃变性45 s, 65℃退火45 s,72℃延伸30 s, 10个循环;95℃变性45 s, 55℃退火45 s,72℃延伸30 s,25个循环;最后72℃延伸10 min。反应完成后,PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,4℃保存待用。
1.6 DGGE分析
DGGE参考Muyzer等的方法[20],所用的仪器为美国Bio-rad公司的The D-code Universal Mutation Detection System电泳系统。DGGE电泳所用的胶浓度为8% (丙烯酰胺/双丙烯酰胺37.5:1),变性剂为尿素和甲酰胺,其浓度梯度为40%~75%,电泳缓冲液1×TAE,上样缓冲液溴酚蓝,电泳电压70 V,电流100 mA,电泳时间720 min。将第二次PCR产物浓缩至20 μl用于DGGE分析。电泳完成后,将DGGE产物于Goldview染色半小时,凝胶成像仪中观察结果并照相。利用quantity one软件分析结果(Adobe Systems, Inc., Mountain View, Calif.)。
2 结果和讨论
2.1 不同植被根际土壤性质
表1 不同植被根际土壤性质
Table 1 Different vegetation rhizosphere soil properties
样品
samble 水溶性盐含量
Water-soluble
(g/kg) 有机质含量
organic
(g/kg) PH
花梨木palisander
铁木hophornbeam
亚热带常绿阔叶林Subtropical evergreen broad-leaved forest
针叶林Coniferous forest
红树林mangrove forest
樟木camphorwood 14.20
4.40
7.15

12.5
5.63
15.50 67.29
53.94
40.71

14.40
106.64
68.27 4.88
5.79
4.68

6.47
5.99
6.00
土壤微生物的量受植被类型的影响,不同的植被类型,由于其地上部分生物量的差异,使得土壤中的有机碳量明显不同,不同植被的种类,其枯落物的质量也不尽相同,这两个因素均会影响土壤微生物的活动[21]。不同植被根际土壤性质如表1,土壤平均含盐量为9.9 2 g/kg,其中铁木的含盐量最低,为4.40 g/kg,樟木的含盐量最高,为15.50 g/kg。土壤有机质含量较高,大约为58.54 g/kg,最高是红树林为106.64 g/kg,最低是针叶林14.40 g/kg。PH 大约为4.68~6.47,偏酸。
2.2 不同植被根际土壤可培养粘细菌的分类鉴定

图1粘细菌部分子实体图片
Fig.1 Morphological characteristics of fruiting body of some myxobacteria strains
A: E-2#-3 Cystobacter sp.;B: E-2#-1 Myxoxoccus fulvus; C: E-4#-1 Corallococcus coralloides;D: 43-5#-1 Corallococcus coralloides ;E:43- 1#-2 Myxoxoccus xanthus; F:43-1#-3 Corallococcus exiguous ; G:E-5#-1 Polyangium; H: E-5#-3 Myxoxoccus stipitatus;(1# for palisander , 2# for hophornbeam , 4# for Coniferous forest , 5# for mangrove forest)
粘细菌的形态特征主要包括:营养细胞形态、子实体形态、粘孢子形态以及它们特征性的菌落结构,粘细菌的分类主要保持在形态上,且由于其形态的复杂性决定着形态分类比其他细菌更为可靠﹝1﹞。Spröer, C.﹝22﹞等曾证实了形态分类是与粘细菌在种水平上的分类相吻合的实验,并认为形态分类对粘细菌新种鉴定仍是一种可靠的手段。根据《Bergey's Manual of Determinative Bacteriology》 (第九版)[23]和《Prokayotes》(第二版)[24]的粘细菌分类标准,分离得到粘球菌属(Myxococcus)11株,珊瑚球菌属(Corallococcus)13株,孢囊杆菌属2株(Cystobacter)(未纯化),多囊菌属(Polyangium)2株,其中,红树林分离得到的粘细菌种类最多 ,共7株;其次是铁木和亚热带常绿阔叶林,均为6株;花梨木和针叶林为3株,樟木最少为2株(表2)。
橙色粘球菌(Mx. Fulvus )的子实体橘黄色、球形且比较粘滑,;黄色粘球菌(Mx. Xanthus)的子实体黄色、球状、表面光滑,粘液较多;弱小珊瑚球菌(Cc. exiguous)为白色,球形,在自然条件下的子实体较小;珊瑚状珊瑚球菌(Cc. coralloides)的子实体形态多样,波浪状或珊瑚状,黄色,较粘滑;孢囊杆菌属(Cystobacter)的孢子囊无柄、单个或成群,圆形、或盘卷,褐色;叶柄粘球菌(Mx. Stipitatus),是具有带柄的粘球菌,子实体黄色或粉色,表面光滑;多囊菌属(Polyangium)子实体白色或粉色,圆形、刻蚀培养基。
表2 不同植被根际土壤可培养粘细菌多样性
Table 1 Diversity of culturable myxobacteria in rhizosphere soil samples with different vegetation
样本Sample Myxococcus´ Corallococcus Cystobacter Polyangiun Total
花梨木palisander 2 1 0 0 3
铁木hophornbeam 2 3 1 0 6
亚热带常绿阔叶林Subtropical evergreen
broad-leaved forest 2 3 0 1 6
针叶林Coniferous forest 2 1 0 0 3
红树林mangrove forest 3 3 1 0 7
樟木camphorwood 0 2 0 0 2
Total 11 13 2 1 27
2.3 不同植被根际土壤可培养粘细菌的分子鉴定
粘细菌菌株结合16S rDNA 进行序列分析,将其鉴定到属。6种不同植被根际土壤可培养的粘细菌共分离得到19株,依据粘细菌的形态结构以及16S rDNA 序列分析(图2),利用5个不同种属的粘细菌建立的系统发育树,初步鉴定粘细菌分属于三个属,Ⅰ类为粘球菌属(Myxococcus)、Ⅱ类为珊瑚球菌属(Corallococcus)、Ⅲ类为多囊杆菌属(Polyangium)。

图2 6株代表粘细菌16S rDNA的系统发育树
Figure 2. Phylogenetic tree of 7 myxobacteria strains based on 16S rDNA gene order. The numbers at the nodes
indicate the bootstrap values based on neighbor-joining analyses of 1000 sample date sets. The scale bar represents the estimated number of base changes per nucleotide sequence position. The numbers in parentheses are accession numbers of sequences.(1# for palisander , 2# for hophornbeam , 3# for Subtropical evergreen broad-leaved forest , 4# for Coniferous forest , 5# for mangrove forest )
2.4 DGGE分析不同植被根际土壤粘细菌的多样性






不同植被根际土壤粘细菌DGGE图谱见图3。由表3可知,花梨木、铁木、亚热带常绿阔叶林、针叶林、红树林、樟木根际土壤中粘细菌的物种丰度(S)分别为16、24、34、26、30和24,多样性指数(H)分别为 2.10、2.53、3.49、2.62、2.77和2.73,与可培养粘细菌(表2)相比较,土壤中存在大量的未培养粘细菌 ;而样本间的相似性系数(表4)表明,花梨木与针叶林土壤样品粘细菌相似性系数最低,为2.4%,铁木与红树林土壤样品粘细菌相似性系数最高,为47.4%,说明不同植被下粘细菌群落结构存在差异。
 
 
 
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